興奮劑檢測

在體育比賽中，有些運動員為了爭取取得好名次、提高成績，常服用一些藥物，企圖憑借藥物作用獲得榮譽。這種做法損害了體育運動的本來目的，也違反了奧林匹克公平競賽的原則。同時，因藥物的毒副作用嚴重地威脅著運動員的身體健康，國際奧委會（IOC）明文規(guī)定禁止運動員服用某些藥物，并自1968年起在奧運會比賽中對運動員進行“濫用藥物”的檢測，若查出他已服用，便立即取消其參賽資格及所得名次。由于最早服用的藥物多為興奮性藥物——刺激劑類，所以盡管以后也禁用了其他類型的藥物，但在我國則常常將所有的禁用藥物統(tǒng)稱為“興奮劑”，有關的檢測工作則統(tǒng)稱為“興奮劑檢測”。正確的叫法應為“濫用藥物”及“濫用藥物檢測”，分別對應于英文“doping”和“doping control”。為方便起見，本文仍使用“興奮劑”一詞，即包括所有的禁用的濫用藥物?！?nbsp; 一 服用藥物歷史 在競賽中服用各種物質(zhì)以求獲得優(yōu)勢的做法已有多年歷史。早在公元前600年，古羅馬的斗士就使用過刺激劑。公元前3世紀，希臘人也曾服用過蘑菇以求提高成績。19世紀80年代在法國的自行車600km比賽中發(fā)生過運動員因服用藥物而死亡。1910年已開始對參賽馬匹的唾液進行藥物檢查。在1960年，羅馬奧運會上發(fā)生了丹麥自行車運動員Kurt EnemarKnud Jensen因服用苯丙胺類而死亡的事件。在1967年，環(huán)法自行車賽中英國的運動員Tommy Simpson也因服用苯丙胺藥物而喪生。這些事件促使了國際奧委會醫(yī)學委員會對1968年第19屆奧運會開始實行藥物檢查。當時禁用的藥物只有8種，檢測方法是氣相色譜（氫焰離子化檢測器）法和薄層色譜法等。1972年第20屆奧運會時，禁用藥物增加至26種，檢測儀器采用氣相色譜-氮磷檢測器。1976年，又增加了甾體同化激素一類5種禁用藥物，使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀器。1980年公布的禁用藥物為58種，開始采用毛細管氣相色譜法檢測。其后1984年增至69種。1988年再增加β-阻斷劑和利尿劑類藥物，總數(shù)達100種。1991年增加一類多肽，1994年12月IOC公布的禁用藥物共分為七類，計108種。有關歷屆奧運會檢測運動員數(shù)目及陽性結(jié)果列于表1。 表1　 歷屆奧運會的藥物檢測結(jié)果 *其中1金牌，1銀牌，2銅牌子　 **其中3金牌，1銅牌 二 禁用藥物 1995年禁用的藥物，按其性質(zhì)可分為7類（見表2），分述如下： 表2禁用藥品名單（1994，12） 注意：該表并非禁用物質(zhì)的詳盡無遺的一覽表。僅向讀者提供一個較為綜合的禁用物質(zhì)一覽表，于該擴展表中沒有出現(xiàn)的許多物質(zhì)按“及相關物質(zhì)”術(shù)語被認為禁用。 　    1.刺激劑 這類藥物共有41種。它們通過神經(jīng)系統(tǒng)的作用，增強人的精神與體力。其副作用是導致過度興奮與焦慮，進一步影響判斷力而容易受傷，心率及血壓會急速上升，有可能造成脫水、腦溢血及心臟病發(fā)作。上述兩例運動員的死亡就是服用這類藥物引起的。這類藥物中含咖啡因，奧委會規(guī)定尿中咖啡因含量超過12μg/ml才算違禁。 2.麻醉劑 這類藥物共有10種。服用后可產(chǎn)生痛快感及心理亢奮，并能降低痛感，以致在參賽中造成更嚴重的傷害。這類藥物多有成癮性，會引起很多生理及心理問題。 3.合成類固醇及β2激動劑 這類藥物共27種。合成類固醇又稱甾體同化激素，是雄性激素衍生物。這類藥物具有增長肌肉的作用，為很多運動員口服或注射使用，但副作用也很嚴重，會干擾人體的自然激素平衡，男人服用后會發(fā)生抑制雄性激素分泌，睪丸縮小，胸部擴大，早禿等現(xiàn)象；女人服用后，會發(fā)生男性化，肌肉增生，月經(jīng)失調(diào)，毛發(fā)增多等現(xiàn)象。有些作用還是不可逆的。過多地使用這類藥物還會引起嚴重的肝、腎損傷、并發(fā)肝癌及心臟病癥等。這類藥物中的睪酮是人體自然分泌的一種激素，所以規(guī)定要測定睪酮與其異構(gòu)體表睪酮之比值，大于6時可判斷為使用了此類藥物。另有幾種β2激動劑，據(jù)認為也有類似作用。 4.β-阻斷劑 這類藥物共有12種。原為降低血壓和降低心率的藥物，但同時具有鎮(zhèn)靜作用。對于射擊、射箭等項目的運動員，穩(wěn)定神經(jīng)，提高成績。 5.利尿劑 共13種。這類藥物會促進排尿，使尿液變稀，使禁用藥物在尿中的濃度減小而不易查出。還可使體重下降，因此在一些有體重限制的比賽項目中常有運動員服用。 6.遮蔽劑 共2種。表睪酮是因為使用后可使睪酮與表睪酮的比值變小，從而遮蔽了睪酮的違禁使用。另一藥物丙磺舒則在服用后可抑制合成類固醇類藥物在尿中的排出，因而使此類藥物在尿中的濃度降低，可能不被檢出。 7.肽類激素 共4種。都是內(nèi)源性激素，使用后或可起到雄性激素作用，或可增加身體耐力，因而也被禁用。 禁用藥物除去上述這些品種外，還包括結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與這些藥物相似的物質(zhì)，所以實際禁用藥物決不限于已列出的這些，會大大超過這個數(shù)目。這些類似的藥物都做為“有關化合物”，也是禁用的，是為了防止運動員取巧，服用新發(fā)明的某些藥物?！?nbsp; 檢測手續(xù) 興奮劑檢測都是通過尿樣的分析來進行的。被檢查的運動員一般是獲得了名次的，對未獲名次的則是隨機選擇。比賽結(jié)束后一個小時內(nèi)，被選中的運動員需去取樣站報到，有專人伴隨左右，直至取得尿樣為止。一般需取尿樣至少75ml，分裝兩個瓶內(nèi)，一瓶裝約50ml，稱為A樣，另一瓶裝25ml，稱為B樣。將A樣與B樣密封、編號，再裝入一個袋中，密封，冷凍保存，送往檢測中心分析。在分析時，先用A樣進行，應在24小時內(nèi)得出結(jié)果，如查出尿樣中有禁用藥物，則由檢測中心通知組織委員會，再通知運動員及其所在體育隊隊長、隊醫(yī)。大家會同當面取出B樣再進行分析復審，如仍檢測出有禁用藥物，則由醫(yī)學委員會討論決定采取措施。 由于服用藥物影響運動員的聲譽，所以檢測工作要求極嚴格，并采取嚴密的保安措施，以防止各種弄虛作假的欺騙行為?！?nbsp; 四 檢測實驗室的資格 對檢測興奮劑的實驗室，國際奧委會有一套規(guī)定的申請手續(xù)與方法，經(jīng)測試合格后，才有資格進行這項工作，其所發(fā)出的分析結(jié)果報告才被認為有效?，F(xiàn)在的規(guī)定是：如欲承擔某國際性比賽的興奮劑檢測，必須在比賽前一年通過正式考試，而在參加正式考試前的半年至一年內(nèi)，要先通過3次預考試。每次考試須分析10個未知尿，并在24小時內(nèi)得出正確結(jié)果。如有一個不正確，須重新補做2個未知樣品并得出正確結(jié)果。如只做對7個考試尿樣，則作不及格論，須過一年后再行申請考試。 考試合格的實驗室的有效工作期限為一年，翌年初須進行復核。復核時要分析8個未知尿樣，并得出正確結(jié)果，做錯1個時，可補加2個未知樣品。如上所述，如復核不能通過，則該實驗室的檢測資格即被取消。 國際奧委會醫(yī)學委員會對申請興奮劑檢測資格考試的實驗室首先要對其人員組成、業(yè)務能力、過去成就、實驗室設備、所用興奮劑檢測方法、禁用藥物標準品、禁用藥物陽性尿、原型藥物和必要的代謝物的氣相色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)等等進行審查，認為合格后才同意其申請。較困難的是標準品的收集和陽性尿的取得，因為禁用藥物是世界各地生產(chǎn)的、需通過多種渠道才能收集完全；有些藥物還需要特殊許可才可攜帶或運輸郵寄。陽性尿的取得則要有自愿服用這些藥物的人按時收集尿液，作為檢測時的對照標準。除了用運動員的尿樣分析結(jié)果來確證其是否服用某藥物外，同時要有此藥物的標準品、陽性尿和空白尿的色譜和質(zhì)譜圖譜，共同對照比較。當尿樣與標準品和陽性尿的數(shù)據(jù)完全相同時才可確證?！?五 檢測步驟 尿樣由專人送至檢測實驗室后，需登記、編號，并測量某些基本數(shù)據(jù)，如pH、比重、顏色、體積及有無沉淀等。然后將尿樣分取數(shù)份，按組進行篩選，若篩選中查出有違禁藥物，則需進一步確證其存在。 色譜方法是較理想的檢測手段。1967年報道的刺激劑系統(tǒng)檢測方法分為三步：第一步為篩選，第二、三步為確證。用兩種提取方法以氣相色譜法（GC）、薄層色譜法（TLC）進行分離鑒定，使用了4種GC填充柱系統(tǒng)，氫焰離子化檢測器，可檢出40種興奮劑。其后隨著色譜技術(shù)的發(fā)展及禁用藥物的增加，檢測方法也相應地不斷改進。1972年采用了程序升溫方法，并用氮磷檢測器檢測。1976年使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用手段檢測甾體，1980年開始用毛細管氣相色譜法檢測，至1984年大體基本定型，并增加了用高效液相色譜法檢查幾種特定藥物及咖啡因定量等工作。1988年增加了2類藥物，β-阻斷劑多用氣相色譜法檢出，利尿劑則用高效液相色譜法檢測。目前一般按興奮劑類別分為4組或5組進行。各實驗室所用方法的原理大同小異，具體試驗條件則根據(jù)自己的具體情況而有所不同。檢測的第一步是篩選，如未查出任何禁用藥物即做為陰性尿，不再考慮；如查出有禁用藥物存在，則仍需進一步分析，稱為“確證”?，F(xiàn)以我們在第十一屆亞運會所用的檢測方法為例，說明如下： 1.篩選方法 尿樣送到試驗室后，分別取數(shù)毫升放小試管內(nèi)，分交各組進行篩選實驗。共分為：揮發(fā)性含氮化合物組、難揮發(fā)含氮化合物組、利尿劑及特殊結(jié)構(gòu)化合物組、甾體同化激素組。 （1）揮發(fā)性含氮化合物組 主要檢測刺激劑。這類藥物多以游離形式排出，其檢測流程如圖1，所用氣相色譜條件列于表3。 （2）難揮發(fā)含氮化合物組 主要檢測麻醉鎮(zhèn)痛劑和β-阻斷劑。這兩類藥物多以結(jié)合形式排出，因此需先水解，使之游離，再進行衍生化后檢測，其方法流程如圖2，色譜條件如表4所示。 

表3氣相色譜操作條件

表4 氣相色譜操作條件

（3）利尿劑組藥物經(jīng)提取后用高效液相色譜法分析檢測，此組同時檢測2種興奮劑，咖啡因和匹莫林，檢測程序和色譜條件分別見圖3和表5。

表5　 液相色譜操作條件

（4）甾體同化激素組 此類藥物有的以游離形式，有的以結(jié)合形式排出，我們所用的方法為同時檢測。其流程和色譜條件如圖4和表6所示。

表6 氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件

2.確證方法 經(jīng)篩選判為陽性的尿樣，需進一步加以確證，根據(jù)規(guī)定，確證結(jié)果須給出藥物或其代謝物的質(zhì)譜圖，因此在確證方法中均使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，確證時的分組同篩選方法中所述。 （1）揮發(fā)性含氮化合物組方法同篩選，最后之提取物濃縮后進樣于GC/MSD。色譜條件見表7。 表7　 氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件    （2）難揮發(fā)含氮化合物組方法同篩選，最后之衍生化產(chǎn)物取小量進樣于GC/MSD。色譜條件見表8。 表8　 氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件    （3）利尿劑組此組藥物需衍生化，然后進樣于GC/MSD。方法見圖5（a，b）色譜條件見表9。 表9氣-質(zhì)聯(lián)用操作條件    （4）甾體同化激素組 方法均同篩選，唯最后得出全質(zhì)譜圖作為確證。 現(xiàn)代的興奮劑檢測實驗室多采用自動化程度較高的儀器，并由計算機控制，可以自動進樣，提高準確性和重現(xiàn)性，并可編制檢測程序，大大方便了此項工作。 需要提出的是禁用藥物中的肽類激素藥物是1990年以后才提出的，目前還沒有很好的檢測方法，同時因為它們都是人體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)，在分析方法和數(shù)據(jù)積累、限量等方面還需要做更多的工作才能訂出較合適的標準?！?nbsp; 六　 我國的興奮劑檢測工作 為迎接1990年第十一屆亞運會在北京召開和承擔運動員尿樣的檢測工作，于1986年9月由中國醫(yī)學科學院藥物研究所和國家體委體育科學研究所協(xié)作，共同籌建我國的興奮劑檢測中心。經(jīng)過三年的努力，1989年3月開始，接受了IOC醫(yī)學委員會興奮劑和體育生化分委會的三次預考和兩次水平考試，共38個未知尿樣均獲得了準確結(jié)果，順利通過。于1989年11月正式考試，分析10個未知尿樣，又按時得出全部正確結(jié)果，同年12月8日，IOC副主席、IOC醫(yī)學委員會主席Alexandre de Merode親王寫信給中國興奮劑檢測中心，正式通知確認其為合格的興奮劑檢測實驗室。因此我國成為當時世界上第20個、亞洲第3個合格的實驗室，可以獨立承擔各種運動比賽的興奮劑檢測工作。此后每年復試也都合格，一直保持了此資格?，F(xiàn)在該檢測中心設在國家體委運動醫(yī)學研究所內(nèi)。